26年WP生物科学 卡那霉素抗性基因的TA克隆及蓝白斑筛选条件优化26.16-AI24.93全日制(9354字).docx

I摘 要本文以 pGM-T 为载体，卡那霉素抗性基因为插入片段，通过对蓝白斑筛选与抗性筛选的联合分析确定蓝白斑筛选的准确率，在此基础上，系统地优化了连接反应时间及感受态细胞效率对阳性克隆产量的影响：CaCl2浓度为 100 mM 时 DH5α 感受态细胞的转化效率最高，不同连接时间及温度的组合对重组效率有明显影响，最优条件为 4℃连接 6 h 重组率达87.19%，而 16℃连接 0.5 h 未获得任何阳性克隆。蓝白斑筛选与卡那霉素抗性双重验证的结果一致表明，白斑中阳性率可达 85%以上，因此本文既很好地验证了蓝白斑筛选作为快速初筛方法的可靠性，又明确了 CaCl2...